一、柱體積的計(jì)算

我們?cè)谝恍_洗方法的資料中，經(jīng)常會(huì)看到10倍柱體積或者20倍柱體積的說法。那么柱體積應(yīng)該如何計(jì)算呢？我們可以把色譜柱想象為一個(gè)圓柱形，因此可以參考圓柱形計(jì)算公式。

V=πr²L

V=色譜柱體積(mL)  r=色譜柱半徑(cm)  L= 色譜柱長(zhǎng)度(cm)

常規(guī)250*4.6mm的規(guī)格，柱體積經(jīng)計(jì)算為4.15mL，以1mL/min的流速10倍柱體積就是42min左右。以下是一些常見規(guī)格的柱體積值，可作為參考。

二、Kromasil反相C18柱的沖洗

反相C18柱是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛的固定相之一，首先我們先從反相C18柱的常見情況沖洗進(jìn)行介紹，分別是：一般污染的沖洗、使用緩沖鹽后的沖洗、生物樣品分析后的沖洗。

1、一般污染的沖洗

一般污染是指的是我們每次分析使用后常見的污染情況，例如試劑和樣品雜質(zhì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生的污染，或者是一些聚合物的形成等。

①   高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗10倍柱體積。這樣可以將殘留在色譜柱中的緩沖鹽和一些極性化合物沖洗干凈；

②   高比例的有機(jī)相（例如：80%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗10-20倍柱體積。高比例有機(jī)相可以將一些疏水性的雜質(zhì)沖洗干凈；

③   如果執(zhí)行上述沖洗之后還是污染問題沒有被解決，可以選擇異丙醇沖洗10-20倍柱體積。

2、使用緩沖鹽后的沖洗

流動(dòng)相中時(shí)常會(huì)加入一些緩沖鹽，這些緩沖鹽可能會(huì)在色譜柱中析出，導(dǎo)致柱壓升高等問題，影響后續(xù)使用。

①   開啟柱溫箱，高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗20倍柱體積；

②   以未加入緩沖鹽的方法起始比例流動(dòng)相進(jìn)行平衡。

3、生物樣品污染

生物分析實(shí)驗(yàn)中，通常前處理較為復(fù)雜，導(dǎo)致樣品無(wú)法處理干凈。可能會(huì)殘留小分子肽等物質(zhì)，其會(huì)吸附在色譜柱的管壁或者篩板上，造成柱壓高、峰型差、分離度降低等問題。

①   在流動(dòng)相的有機(jī)相中加入0.1%的三氯乙酸，以增強(qiáng)對(duì)吸附蛋白質(zhì)的洗脫；

②   如果問題仍未解決，可嘗試在色譜柱里面進(jìn)100uL三氮乙醇，嘗試清洗強(qiáng)保留的蛋白

三、Kromasil色譜柱沖洗指南

關(guān)于其他常見色譜柱的沖洗方法，可按照以下提示進(jìn)行嘗試，若使用其他品牌的色譜柱請(qǐng)和廠商工程師確認(rèn)后進(jìn)行參考。

1、反相柱的沖洗

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

①   90%水-乙睛溶液

②   100%四氫呋喃

③   95%乙腈-水溶液

④   不含鹽的初始比例流動(dòng)相

⑤   初始比例流動(dòng)相平衡

2、正相柱的沖洗-硅膠柱

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

①   異丙醇

②   甲醇

③   乙酸乙酯

④   流動(dòng)相

3、正相柱的沖洗-氰基柱、二元醇基柱

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

①   三氯甲烷

②   異丙醇

③   二氯甲烷

④   流動(dòng)相

色譜柱污染在日常分析中在所難免，因此可以考慮購(gòu)買Kromasil保護(hù)柱來進(jìn)行預(yù)防。Kromasil保護(hù)柱采用分析柱相同填料填充，不增加死體積與不改變分離的同時(shí)，可以有效保護(hù)分析柱，延長(zhǎng)使用壽命。